Haeckel's genealogical tree

どっかの誰かさん依頼の分子生物学２のサポートです。
今回のテストはかなり厳しかった模様。一説によると、発生や生防よりも厳しかったのではないか？戸

の見方も出ています。
また、説明・論文でも重要なワードが抜けていた場合点をくれなかった。とか・・・

さて、そんな分子生物学２ですが、試験前に黒山羊はcDNAライブラリーと、遺伝子ライブラリー、酵素

の特性方法を活かした実験方法などがヤマかなとにらんでいました。
大体、過去問見た感じではその類の問題が多いですので。
追試も似たような範囲の問題になるかと。

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で、まずは本試の問題のおさらいです。
順番と詳しい内容までは分からなかったのですが、問題は以下ような感じ
１．ジデオキシ法について
２．アミノ酸が１７塩基で足りる理由
３．制限酵素で単離した塩基の調べ方

簡単におさらいしておきます
１．ジデオキシ法⇒塩基配列を決定したいＤＮＡの一方のＤＮＡ鎖を鋳型として、それと相補的なＤＮ

ＡをＤＮＡポリメラーゼ（ここではKlenow断片）によって合成し、合成したＤＮＡの塩基配列を解析す

る。というもの。

手順（プリント・シークエンス１を参照）
a.解析したいＤＮＡをあらかじめプラスミドベクターに組み込み、大腸菌で増やしておく。
b.プラスミドを調整し、シークエンスのためには１本鎖にしてプライマーから相補的な塩基配列が結合

する状態にしておく必要があるため、変性させる。
c.解析したいＤＮＡ配列の直前に相補的になるようにプライマーを結合させ、ＤＮＡ合成

DNA合成→klenow断片　dNTP　『ddNTP』
d.アニール（ＤＮＡ合成において鋳型ＤＮＡとプライマーの塩基対形成）が行われる。が、ここで、

ddNTPがdNTPの代わりに取り込まれるものがあると、次のdNTPとホスホジエステル結合が形成できない

ため、反応がここで終了する。
e.１度変性し、新たに合成したＤＮＡをポリアクリルアミドゲル電気泳動で解析する。
塩基対の長さにより泳動距離が異なるため、ddNTPが取り込まれ反応が停止したのが早いものが最も泳

動距離が長いものとして現れる。

これにより、ＤＮＡを解析する
注意点：ＤＮＡ合成は５’末端→なので、泳動距離が長いものから、５’→３’となる。

また、電気泳動のとき、新たなＤＮＡ断片だけを見たいので、鋳型ＤＮＡと区別をつけるために『アイ

ソトープ標識』や『基質としてα-32Ｐ dNTP』を用いる方法もある。

２.アミノ酸が１７塩基で足りる理由（多分、プローブで用いた場合だったと思う）
あるタンパク質から考えうるmRNAを特定しようとしたとき、１７塩基対の組み合わせを考えれば４の１７乗であり、これは１．７×１０の１０乗に相当する。
ヒトゲノムが３×１０の９乗という点から見れば、解析の際に１７塩基の組み合わせで考えれば、重複はほぼ考えられず、プローブとして用いた場合でも偶然ハイブリダイズする可能性は低いからである。

３．制限酵素で単離した塩基の調べ方
多分、alkaline phosphataseとT4 polynucleotide kinase、[γ-32P]ATPを用いたものだと思う。
alkaline phosphataseはＤＮＡorＲＮＡの５’末端のリン酸基を取り除き、ＯＨ基にする。
T4 polynucleotide kinaseはＡＴＰのγ位のリン酸基を５’末端に付加させるので、あらかじめアイソトープ標識しているＡＴＰを用いれば、制限酵素で単離した塩基を調べていくことができる。

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やっておくべきこととしては、
１．用語の確認・酵素の特性を把握
２．実験・手法の確認
ですね。

alkaline phosphatase、T4 polynucleotide kinaseの性質は？
制限酵素の切断部位の配列の決定方法は？→ろ紙電気泳動
cDNA、cDNAライブラリーとは？また、cDNA合成の手法は？
プラスミド、形質転換、ベクターそしてその条件など
青白選択の手法は？
λファージベクターについて
タンパク質からの遺伝子解析の手法は？
ハイブリダイゼーション、融解温度の求め方は？
遺伝子ライブラリーの解析（１７塩基対）
ＤＮＡ配列の決定→ジデオキシ法とは？

ってなところかなと

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