piyotaの【ちぇブラで行こう】

[論文紹介：NMRと標識技術] カテゴリの記事

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  休日前の準備

  ４月２１日時点でやりかけていた研究に関すること　備忘録ともかく自分用備忘録です3Dドメインスワッピングについて　2001年の総説http://www.actabp.pl/pdf/4_2001/807.pdfMariusz JaskólskiM君の実験に活用するかもしれないCryoprotection mechanisms of polyethylene glycols on lactate dehydrogenase during freeze-thawing個人的に読まねばならない論文いろいろと研究のネタを個々から得たい　M君にも読ませたい論文日経バイオテクオンライン　説明は省略AMED　crest/prime募集　6/1正午まで予算の公募要領ページ　割と重要第一三共生命科学振興財団　5/22　電子申請締切　年齢注意富山大学和漢薬総合研究所　伝統医薬品DB実に面白い　備忘録PubchemのSNACのページhttps://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/23669833#section=TopAEに関してScholar　googleで検索してみたここから論文を拾ってセミナーをする予定　次回のセミナーはAE。ブログ村で生命科学系論文紹介のブログを探してみる

  2016.04.21

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  あとで読む論文リソース集 2015.9.9

  PiyotaのWEB上文献セミナー　「あとで読む論文リソース集」使いやすいブックマーク保存集がないので、ときどき明示的にメモしておかないと忘れてしまう危険性。Ubiquitination of the Dishevelled DIX domain blocks its head-to-tail polymerization Nature Communications 6,Article number:6718 doi:10.1038/ncomms7718Wntシグナル伝達系、DishsvelledのDIXドメインの多量化とシグナル伝達メカニズムの解明についてユビキチン化が関連あとで読む Review ArticleState-of-the-art strategies for targeting protein–protein interactions by small-molecule inhibitorsChemical Society Reviews Chem. Soc. Rev., 2015, Advance Article　DOI: 10.1039/C5CS00252D低分子PPI阻害剤に関する総説か？　必読Prevalence, specificity and determinants of lipid-interacting PDZ domains from an in-cell screen and in vitro binding experiments.PLoS One. 2013;8(2):e54581. doi: 10.1371/journal.pone.0054581. Zimmermann P.他We screened the human proteome for PtdInsPs interacting PDZ domains by a combination of in vivo cell-localization studies and in vitro dot blot and Surface Plasmon Resonance (SPR) experiments using synthetic lipids and recombinant proteins. We found that PtdInsPs interactions contribute to the cellular distribution of some PDZ domains, intriguingly also in nuclear organelles, and that a significant subgroup of PDZ domains interacts with PtdInsPs with affinities in the low-to-mid micromolar range. PDZドメインとPtdInsの相互作用の網羅的解析の論文。重要。The PDZ domain of the guanine nucleotide exchange factor PDZGEF directs binding to phosphatidic acid during brush border formation.PLoS One. 2014 May 23;9(5):e98253. doi: 10.1371/journal.pone.0098253. eCollection 2014.LKB1下流でRap2aの上流で働くGEFの話。PAに結合する？面白そうだが・・・何かアイデアのネタになるか？Seamless Ligation Cloning Extract (SLiCE) cloning method.Zhang Y1, Werling U, Edelmann W.Methods Mol Biol. 2014;1116:235-44. doi: 10.1007/978-1-62703-764-8_16.大変に興味深い方法こちらに日本語の解説がブログ村で生命科学系論文紹介のブログを探してみる

  2015.09.07

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  注目論文必読論文備忘録 2015 いろいろ編

  The quantitative and condition-dependent Escherichia coli proteome Alexander Schmidt, Karl Kochanowski, Silke Vedelaar, Erik Ahrné, Benjamin Volkmer, Luciano Callipo, Kèvin Knoops, Manuel Bauer, Ruedi Aebersold & Matthias Heinemannhttp://www.nature.com/nbt/journal/vaop/ncurrent/full/nbt.3418.html22の培養条件で大腸菌に発現する2300種（遺伝子の55%）以上のタンパク質を定量した論文らしい。M9発現でのタンパク質収量アップのヒントはあるか？Proline conformation in a functional Tau fragmentJournal of Molecular Biology　Available online 2 December 2015http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022283615006853 Puneet Ahuja, François-Xavier Cantrelle, Isabelle Huvent, Xavier Hanoulle, Juan Lopez, Caroline Smet, Jean-Michel Wieruszeski, Isabelle Landrieu, G. Lippens, Lippens先生のところは長らく方法論を開発しつつIDPである全長TAUの帰属などに取り組んでいた。Force-Field Induced Bias in the Structure of Aβ21-30: A Comparison of OPLS, AMBER, CHARMM, and GROMOS Force-Fields http://pubs.acs.org/doi/pdfplus/10.1021/acs.jcim.5b00308Micholas Dean Smith, Srinivasa Rao Jampani, Elizabeth Segelken, and Luis R. Cruz CruzDOI: 10.1021/acs.jcim.5b00308どうすんの、これ、って感じの論文　helixを取りやすい力場、beta-sheetをとりやすい力場、水の置き方、でいろいろ極端な結果に。ブログ村で生命科学系論文紹介のブログを探してみる

  2015.08.31

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  備忘録～～後で読むリソース一覧

  本当に後で読む時間があるかどうかは微妙しかしメモしておかないと散逸してしまう。あと紙のメモは机上で日常的に紛失しているので。天然変性タンパク質のNMR解析に関する総説http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959440X13000365#Describing intrinsically disordered proteins at atomic resolution by NMRNatureに出たプリオンに関する最新の総説http://www.nature.com/nature/journal/v501/n7465/abs/nature12481.htmlSelf-propagation of pathogenic protein aggregates in neurodegenerative diseasesMolecules誌に出たTompa研からのIDP関連総説http://www.mdpi.com/1420-3049/18/9/10802Self-propagation of pathogenic protein aggregates in neurodegenerative diseases皮膚のバリア機能を高めるアトピー性皮膚炎の治療薬http://togetter.com/li/565290原著論文はまだのようだがアトピーといえばIL33http://www.pnas.org/content/early/2013/08/01/1307321110.abstractブログ村で蛋白質立体構造関連のブログを探してみる

  2013.09.17

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  PiyotaのWEB上文献セミナー　第６回　植物由来IDPの機能

  こういう地味だけれども味のある論文って大好きです。PiyotaのWEB上文献セミナー　第６回　植物由来IDPの機能Protein Sci. 2011 Jan;20(1):42-50. doi: 10.1002/pro.534.Cryoprotective mechanism of a small intrinsically disordered dehydrin protein.Hughes S, Graether SP.植物由来の抗ストレスタンパク質「デヒドリン」K-φ-Kモチーフを持つ40-50aaの保存された天然変性領域を持つデヒドリン族があるcryoprotectant活性あり。NMRで測定したところ、N/C末端のKモチーフがやや硬い構造、真ん中はふにゃふにゃ標的酵素と直接相互作用しない。おそらく静電相互作用が重要。PMID:21031484 詳細イントロダクション15N標識をしたK-φ-Kの天然変性デヒドリンフラグメントを準備NMRで完全帰属→15N-NOE/T1/T2/SSP→N,C末端弱いへリックス、中央部変性結果・考察Rabbit type II LDH protein (cat. no. L2500, Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada)液体窒素による凍結→融解を5回繰り返す。LDHは凍結融解で99%失活プロテクタんとがあるとLDHの活性はほぼ残っている。K2/YSKのほうが、BSAよりもクライオプロテクタント機能が高い（薄い濃度で効いているように見える）→図３凍結融解で失活したLDH：ややオリゴマー？散乱出る、8-ANS蛍光出るK2はプロテクトするだけでなく、散乱やANS蛍光も抑えている塩があるとK2の保護効果がかなり弱まる。ポイントまったく変化しないNMR滴定実験。LDH存在下と非存在下でK2ペプチドのNMRシグナル変化せず。K2とLDHの相互作用はひょっとしたら静電相互作用したがって塩を入れると保護機能が弱まるというわけで、仮説。そのほかの天然変性タンパク質にもクライオプロテクタント活性があるかもしれない　　↓やってみよう！ブログ村で生命科学系論文紹介のブログを探してみる

  2013.02.13

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  PiyotaのWEB上文献セミナー　第４回　天然変性タンパク質の精製法

  Obtaining highly purified intrinsically disordered protein by boiling lysis and single step ion exchange.Livernois AM, Hnatchuk DJ, Findlater EE, Graether SP.Anal Biochem. 2009 Sep 1;392(1):70-6. doi: 10.1016/j.ab.2009.05.023.天然変性タンパク質 intrinsically disordered proteins = 二次構造・三時構造を持たないタンパク質これまで構造生物学(X線・NMR)の研究対象はよく構造をとっているものに限られていたが、近年、IDPの生物学的重要性が高まった。NMRでIDPを研究する上で安定同位体標識が必須、大腸菌発現が定法である。問題は分解されやすいこと！今回著者らは植物由来dehydrinタンパク質のNMR試料調製法を開発した。キモは、大腸菌ペレットをボイル処理して、大腸菌由来プロテアーゼを失活沈殿させると同時にIDPを可溶化することである。そののち、陽イオン交換カラムをかけることで、2ステップで高純度のIDP試料を得ることができた。PMID:19464251 詳細イントロダクションデヒドリン(dehydrin)とは植物の乾燥脱水ストレス応答タンパク質9～200KDaの広範な分子量分布典型的な3つのセグメント　K- /S- /φ- segment + polar-rich seg.K-segment 15aa (EKKGIMDKIKEKLPG) 両親媒性αへリックス、膜親和性？デヒドリンに必ず存在、高く保存1～11リピートY-segment (V/T)DEYGNP　あるとしたらN末端、ない時もある。1～3コピー。機能詳細未知・ヌクレオチド結合モチーフに似てるかも。φ-segment YとKの間にリピートとして存在、(G,P,A,Tリッチ）全体的に親水性アミノ酸に富み、Trp/Cysがない。デヒドリン機能保水・タンパク質保護・膜構造維持酵素の低温失活を保護抗凍結活性(AFP-like)方法発現系pET22b・BL21(DE3)LB培養時 OD 0.7～0.8でIPTG(0.4mM)インダクション→3時間集菌M9培養時。はじめLBで培養し菌体量0.7～0.8ODで5000gx30minで集菌。その後一回washしてM9で再培養、一時間後IPTG、16時間培養して集菌。破砕・精製・ボイル処理50mL / L-cultureの水に懸濁沸騰水に浸す。5分ごとに手動で撹拌、5～30min70,000g x 30minで沈殿除去、更に0.22um フィルター陽イオン交換　HiTrap-FF-SPその他純度確認に逆相HPLC : Waters Symmetry 300 C18 HPLC column (5 μm, 4.6 × 250 mm2) : TFA-MeCN系MALDI-TOF確認AFP活性を測定しているポイントボイル時間の最適化：30minまで単調増加ボイル処理のみで、sonication+Ni2+-IMACと同程度の精製効率M9での発現は悪い：発現中に分解してしまっている可能性はないか？当たり前のことであるがこういう当たり前は重要かもしれない。短いdehydrinにAFP活性はなかった　^^;ここまで調べた感じでは、精製中：精製後のプロテアーゼ分解をケアしている論文はある、が、培養中の分解についてまでケアしている論文は見つけられていない・・・←本当か？おまけ～この論文を引用している論文のうちめぼしいもの A general method of protein purification for recombinant unstructured non-acidic proteinsCampos, Francisco; Guillen, Gabriel; Reyes, Jose L.; et al.PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION 2011: 80: 1: 47-51 DOI: 10.1016/j.pep.2011.06.007 Cryoprotective mechanism of a small intrinsically disordered dehydrin proteinHughes, Stephanie; Graether, Steffen P.PROTEIN SCIENCE 2011 : 20: 1: 42-50 DOI: 10.1002/pro.534 ↑　この論文によるとcryoprotective活性については、ないわけではないようだ。ブログ村で生命科学系論文紹介のブログを探してみる

  2012.10.22

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  PiyotaのWEB上文献セミナー　第３回　大腸菌の嫌気培養用発現系

  PiyotaのWEB上文献セミナー　第３回Role of alternative promoter elements in transcription from the nar promoter of Escherichia coli.M S Walker and J A DeMossJ Bacteriol 1992, 174 no. 4 1119-1123 大腸菌は基本的には好気的な細菌だが、嫌気条件でも生育する。その際活性化される典型的な転写活性化因子の一つがfnr (fumarate and nitrate reductase) これがあると、培地中の硝酸を還元して酸素を得て、その酸素で好気的呼吸を行いエネルギーを酸性できるようになる。narGHLIオペロンのプロモータ領域にはFnr結合部位の他に、硝酸により活性化されるNarL結合部位もあり、双方の制御を受けている-10/-35に変異を入れたプロモータにより、硝酸イオンには反応せずに、嫌気条件のときだけスイッチがオンになるプロモータを作ることができたPMID: 1735706 詳細ポイントplasmid pMW618が嫌気条件でのみ活性化するプロモータ。蛋白質の生産技術や、安定同位体の標識技術に使えるかもしれない。ブログ村で生命科学系論文紹介のブログを探してみる

  2012.10.01

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  PiyotaのWEB上文献セミナー　第２回 HIV-1 Nef

  PiyotaのWEB上文献セミナー　第２回The solution structure of HIV-1 Nef reveals an unexpected fold and permits delineation of the binding surface for the SH3 domain of Hck tyrosine protein kinaseGrzesiek, S; Bax, A; Clore, GM; et al.　はい、ステファン先生の論文です。NATURE STRUCTURAL BIOLOGY VOL 3 (4) 340-345 DOI:10.1038/nsb0496-340 発行: APR 1996 被引用数: 229 (横断検索から) 今となっては古典、15年前のNMR構造。HIV-NefのNMR構造決定に、併せてNMR滴定実験を行ってSH3結合部位を同定している。PMID:8599760 詳細ポイントこの論文をとりあげたのは唯一備忘録のためです。活目して見よ、この図を！！ちょっとマニアックすぎましたかねぇ。ブログ村で生命科学系論文紹介のブログを探してみる

  2012.09.17

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